RNA-Sequencing
Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist die neueste Technologie zur Untersuchung des Transkriptoms, d. h. des vollständigen Satzes von RNA-Transkripten, die das Genom in einer Zelle oder Zellpopulation ablesen. Mit dieser Technologie werden RNA-Moleküle im Transkriptom direkt sequenziert, um ihre Herkunftsgene und ihre Häufigkeit zu bestimmen. Die RNA-Spezies müssen vor der Sequenzierung einen Vorbereitungsprozess für die Sequenzierungslibrary durchlaufen. Die Libraries werden dann sequenziert, um Millionen von Reads für jede Probe zu erzeugen. Nach der Sequenzierung werden die generierten Reads auf das Referenzgenom abgebildet, um ihren genomischen Ursprung zu identifizieren. Die Gesamtzahl der Reads, die einer bestimmten Genomregion zugeordnet werden, gibt Aufschluss über den Grad der Transkriptionsaktivität in dieser Region. Je höher die Transkriptionsaktivität einer Genomregion ist, desto mehr Kopien von RNA-Transkripten werden produziert und desto mehr RNA-Seq-Reads werden erzeugt. RNA-Seq ist im Wesentlichen ein Zählspiel.
GMAK bietet fünf Arten von RNA-Seq-Diensten an, die im Folgenden beschrieben werden:
- mRNA-Seq: Beginnt mit 100 ng bis 1 ug hochqualitativer total-RNA. Erstellt eine Library aus mit Poly-A angereicherten mRNA-Spezies. Das Ziel ist die Identifizierung differentiell exprimierter proteinkodierender Gene. Am häufigsten nachgefragt.
- Total RNA-Seq: Beginnt mit 100 ng bis 1 ug Gesamt-RNA. Die Libraryvorbereitung basiert auf der Abreicherung von rRNA. Zielt sowohl auf proteinkodierende Gene als auch auf lange nichtkodierende RNAs ab. Kann auch für degradierte RNA verwendet werden, z. B. aus FFPE- oder Laser-Capture-Mikrodissektat-Proben extrahiert.
- Low-input RNA-Seq: Geeignet für begrenzte Mengen an total-RNA im Bereich von 5-100 ng.
- Small RNA-Seq: Bereitet Sequenzierungslibraries für kleine RNA-Spezies, z. B. miRNAs, aus total-RNA vor. Es kann mit 100 ng bis 1 ug (Standard-Input) oder 5 bis 100 ng (Low-Input) Gesamt-RNA begonnen werden.
- Einzelzell-RNA-Seq
Benutzer, die noch keine Erfahrung mit Bulk-RNA-Seq haben, können sich an den Dokumenten der Plattform RNA-Seq Workflow Steps and Examples und dem RNA-Seq Decision Tree orientieren, um zu entscheiden, welche Art von RNA-Seq-Service benötigt wird.
Leselänge und Sequenzierungstiefe
- Standard mRNA- or total RNA-Seq: Paired-End 50 Reads werden meist für die Erstellung von allgemeinen Genexpressionsprofilen verwendet. Zur Untersuchung alternativer Spleißvarianten werden häufig längere Paired-End-Reads (bis zu 150 bp) angefordert. Bei der Sequenzierungstiefe sind 25-30 Millionen Reads pro Probe in der Regel für die Erstellung von allgemeinen Genexpressionsprofilen geeignet, während 40-50 Millionen Reads für die Erkennung von Spleißvarianten empfohlen werden.
- Low-input RNA-seq: Die Leselänge bleibt die gleiche wie bei der standardmäßigen mRNA- oder Gesamt-RNA-seq. Die Sequenzierungstiefe kann in Abhängigkeit von der Menge des Ausgangsmaterials bis zu einem gewissen Grad reduziert werden.
- Small RNA-seq: Small RNA-seq: GMAK generiert paired-end 50 bp Reads für Small RNA-seq. Die empfohlene Sequenzierungstiefe beträgt 5-10 Millionen Reads pro Probe.
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos
Sample Submission
GMAK nimmt nur extrahierte Gesamt-RNA für RNA-seq (keine Gewebe oder Zellen) an. Die Qualität der RNA ist der wichtigste Faktor, der das Endergebnis bestimmt. Nach der Abgabe der Proben führen die Mitarbeiter der Plattform eine Qualitätskontrolle der Proben durch, die die Messung der Qubit-Konzentration und die Generierung der RNA-Integritätsnummer (RIN) mit dem Fragment Analyzer vor der Erstellung der Library umfasst. Eine RIN von 8 ist erforderlich, um mit dem Erstellung von mRNA-seq-Libraries fortzufahren. Eingereichte RNA-Proben müssen außerdem frei von DNA sein, und wir empfehlen, während der RNA-Extraktion immer einen DNase-Behandlungsschritt vorzusehen. Das Vorhandensein von genomischer DNA-Kontamination ist auf Fragment Analyzer Spuren im Bereich von 4-10 kb sichtbar. In Situationen, in denen ein RNA-Abbau unvermeidlich ist, wie z. B. bei der Verwendung von FFPE-Gewebe, wird eine total-RNA-Seq empfohlen, da sie weniger von der Unversehrtheit der RNA abhängig ist. Verwenden Sie unser Sample Submission Formular für die Einreichung von Proben.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard Bioinformatik-Service umfasst Sequenzierungsdaten-QC, Alignment, Normalisierung und differenzielle Expressionsanalyse.
Single-Cell Sequencing
Die GMAK bietet seit 2017 die Einzelzellsequenzierung an. Diese hochmoderne Technologie bietet beispiellose Möglichkeiten zur Untersuchung von Zell-zu-Zell-Variationen, zur Identifizierung/Visualisierung verschiedener Zelltypen/-identitäten in einer Population und zur Ableitung von zellulären Entwicklungsverläufen. Um den Nutzern bei der Erreichung dieser Ziele zu helfen, unterstützt GMAK die Nutzer bei jedem Schritt dieses Prozesses - von der Zellvorbereitung über die Erstellung von Sequenzierbibliotheken bis hin zur bioinformatischen Analyse.
Mit der Weiterentwicklung der Technologie wird die Einzelzellsequenzierung immer vielfältiger, um unterschiedlichen Projektanforderungen gerecht zu werden. Derzeit bietet GMAK die Einzelzellsequenzierung im Hochdurchsatz auf der Grundlage der 10x Genomics-Technologie an
10x Genomics Chromium
- Zielzellzahl: 1.000-10.000 Zellen in jeder Probe
- Input-Typ: frisch zubereitete Einzelzellsuspension (oder Zellkern), fixierte Zellen (oder Nuclei), kryokonservierte und in FFPE eingebettete Zellen.
- Anwendungen: 3'- und 5'-RNA-Seq von Einzelzellen (oder Nuclei), T-Cell- und B-Cell-V(D)J-Clone Profiling, Cell Surface Protein Profiling, ATAC-Seq von Nuclei und Multiome (gleichzeitige ATAC-seq von Nuclei und RNA-Seq an denselben Zellen)
Service-Anfrage
Um ein Einzelzellsequenzierungsprojekt zu initiieren, kontaktieren Sie uns bitte. Die Projektberatung ist kostenlos. Es wird dringend empfohlen, sich vor Beginn eines Einzelzell-Sequenzierungsexperiments mit der GMAK zu beraten, um das Erreichen der Projektziele sicherzustellen.
Einreichung von Proben
Für alle Single-Cell Services vereinbaren Sie bitte im Voraus einen Termin für die Probeneinreichung mit uns.
Empfohlene Sequenzierparameter
- RNA-Seq Libraries - Read 1 von 28 bp (Zell-Barcode und UMI), i7-Index von 10 bp (Probenindex), i5-Index von 10 bp (Probenindex) und Read 2 von 90 bp (Transkript-Insert) mit einer Sequenzierungstiefe von >20.000 Reads pro Zelle;
- ATAC-Seq Libraries - Read 1 von 50 bp (Transponierte DNA), i7 Index von 8 bp (Probenindex), i5 Index von 16 bp (10x Barcode) und Read 2 von 49 bp (Transponierte DNA) mit einer Sequenzierungstiefe von >25.000 Reads pro Zelle
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage zur Verfügung gestellt.
Spatial Transcriptomics
Die 3D Transkriptomik (Spatial Transcriptomics) ermöglicht die Untersuchung der Genexpression im Kontext der Gewebsarchitektur, der Gewebemikroumgebung und der Zellgruppen (insbesondere in Verbindung mit der Einzelzellsequenzierung). Um den rasch wachsenden Bedarf an räumlichen -omics-Studien zu decken, arbeitet die GMAK mit der HZI Core Unit Mouse Histology and Pathology zusammen, die in der Abteilung VMED untergebracht ist. Durch diese interne Zusammenarbeit wird sichergestellt, dass die Nutzer Zugang zu den verschiedenen Techniken haben, die für die Durchführung eines typischen Arbeitsablaufs für die räumliche Analyse erforderlich sind, wie z. B. Gewebevorbereitung, Kryosektion, Färbung, Bildgebung, Qualitätskontrolle des Gewebeschnitts, Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek, Sequenzierung und Datenanalyse. Der etablierte Arbeitsablauf eignet sich sowohl für frisch gefrorenes (FF) als auch für formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe. Gewebeschnitte auf Standard-Glasobjektträgern können auch für die Visium-Plattform von 10x Genomics verwendet werden, da das bei GMAK vorhandene 10x CytAssist-Gerät den Probentransfer von bereits vorhandenen Objektträgern auf Visium-Objektträger ermöglicht. Die Visium-Plattform von 10x Genomics wird seit August 2023 angeboten.
Service-Anfrage
Bitte kontaktieren Sie die GMAK, um ein 3D Transkriptomik Projekt zu initiieren. Wir arbeiten hier eng mit den anderen HZI-Service Plattformen bei den verschiedenen Schritten des Arbeitsablaufs zusammen. Es ist unbedingt empfohlen, sich vor dem Start eines solchen Projektes mit der GMAK in Verbindung zu setzen, um das Erreichen der Projektziele sicherzustellen. Die Projektberatung ist kostenlos.
Whole Genome Sequencing
Whole-Genome-Sequencing (WGS) ist eine Methode zur Bestimmung der vollständigen DNA-Sequenz des Genoms eines Organismus, einschließlich der chromosomalen DNA und der mitochondrialen DNA. WGS bietet einen umfassenden Überblick über das Genom. WGS-Methoden können in De-novo-Sequenzierungsprojekte und Re-Sequenzierungsprojekte unterteilt werden. Welche Methode für welches Projekt? DNA-Seq_Decision_Tree
De novo WGS
Für die De-novo-Sequenzierung von Genomen sind lange Reads von Vorteil wie sie z. B. von Oxford Nanopore Sequenzern (MinION, GridION) generiert werden. Da in der GMAK diese Technologie zur Verfügung steht empfehlen wir einen hybriden Ansatz bei de novo WGS Projekten. Hier werden kurze Reads von Illumina Sequenzern und lange Reads von Oxford Nanopore (ONT) Sequenzern verwendet, um die Assemblierungsergebnisse für Genome zu verbessern.
WGS Re-Sequenzierung
WGS Re-Sequencing ist deutlich kosteneffizienter als de novo WGS, da es nur mit kurzen Reads durchgeführt werden kann, wenn ein hochwertiges assembliertes Referenzgenom zur Verfügung steht.
Sequenzierungsmodus
- Short Reads (Illumina): Paired-End-Lauf von mindestens 150bp, besser 300bp mit einer 50x Coverage des Genomes für eine Re-Sequenzierung und eine 100x Coverage des Genomes für eine de novo Sequenzierung
- Long Reads (ONT): 50x Coverage des Genomes für ein Hybrid-Assembly mit Illumina short reads und eine 200x Coverage des Genomes für eine de novo Sequenzierung
Wir empfehlen für die erfolgreiche de novo Sequenzierung von kleinen Genomen (Bakterien, Viren) unbedingt einen hybriden Ansatz, also die Kombination von kurzen Reads (Illumina) mit langen Reads (ONT).
Für die Methode der Re-Sequenzierung und dem damit verbundenen SNP/Variant Calling empfehlen wir die Verwendung von kurzen Reads (Illumina), da diese Sequenziertechnologie die momentan geringste Sequenzierfehlerrate und damit bessere Vorraussetzungen für nachfolgende qualitative Analyseschritte besitzt.
Service-Anfrage
Bei Bedarf wird eine kostenlose Projektberatung angeboten.
Einreichung der Probe
- Library Prep für Illumina Sequenzer: 150 ng hochwertige genomische DNA erforderlich.
- Library Prep für MinION Sequenzer (ONT) : 1µg HMW DNA
Für die DNA-Quantifizierung werden fluorometrische Methoden, wie Qubit oder PicoGreen, bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau genug.
Verwenden Sie unser Sample Submission Formular für die Einreichung von Proben.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard-Bioinformatik-Service umfasst je nach Methode die Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten, das Alignment, Assembly, Hybrid Assembly, SNP/Variant Calling und eine automatische Annotation.
Whole Exome Sequencing
Obwohl die proteinkodierende Region des Genoms (d. h. das Exom) nur einen kleinen Teil des Genoms ausmacht (weniger als 2 % beim Menschen), ist sie am besten annotiert. So enthält das menschliche Exom etwa 85 Prozent aller bekannten krankheitsbezogenen Varianten. Aufgrund ihrer Kosteneffizienz und der besseren Handhabbarkeit der Daten bietet die Whole-Exom-Sequenzierung (WES) einen idealen Ansatz, wenn eine Whole-Genom-Sequenzierung (WGS) nicht praktikabel oder erforderlich ist.
WES ermöglicht es den Nutzern, ihre Ressourcen auf die Gene zu konzentrieren, die am ehesten einen Einfluss auf den Phänotyp oder die Krankheit von Interesse haben. Durch das Vergleichen der Sequenzen mit der gesamten Aminosäure-kodierenden Region des Genoms führt es zur Identifizierung relevanter Varianten in einem breiten Spektrum von Anwendungen, einschließlich genetischer Krankheiten, Krebsentwicklung und Populationsgenetik.
GMAK verwendet einen Capture-basierten Ansatz, um Exom-Regionen für die Sequenzierung auszuwählen. Wir verwenden biotinylierte Nukleinsäure-Capture-Sequenzen, die komplementär zur Ziel-Exom Sequenz sind, um an genomische DNA-Bibliotheken für das Capture zu hybridisieren. Für unsere WES benötigen wir nur 150ng hochwertige genomische DNA (Human, Mouse).
Sequenziermodus
Für WES werden Paired-End-Läufe mit 100 oder 150 bp und min. 15Mio Reads per Sample empfohlen.
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos.
Einreichung der Proben
Für die WES werden 150 ng hochwertige humane genomische DNA benötigt. Für die Quantifizierung der DNA werden fluorometrische Methoden wie Qubit oder PicoGreen bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau genug.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard WES-Bioinformatik Service für die Detektierung von Varianten umfasst die Qualitätskontrolle der Sequenzierungsdaten, das Alignment und den Variant Call. Die Ergebnisse werden in Form von Variant Call Files (VCF) geliefert.
ATAC-Seq for Open Chromatin Profiling
Das eukaryotische Genom ist stark gepackt, um in den sehr begrenzten Zellraum zu passen. Infolgedessen ist der Zugang zu genomischen Informationen je nach dem Zustand der Zelle streng geregelt. Welche Regionen des Genoms zugänglich sind, sagt viel über den Zustand der Zelle aus. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin, gekoppelt mit Next-Gen-Sequenzierung) ist eine Technik zur Lokalisierung zugänglicher Chromatinregionen.
Wie der Name schon sagt, basiert ATAC-seq auf dem Einsatz einer gentechnisch veränderten, hyperaktiven Transposase (Tn5), die die DNA in offenen Bereichen des Chromatins fragmentiert. Gleichzeitig werden die Enden der fragmentierten DNA mit Sequenzieradaptern markiert. Dieser Markierungsprozess ist ein wesentlicher Bestandteil der ATAC-Seq Library Präparation.
Standard-ATAC-seq: GMAK beginnt mit getaggter gDNA.
Einzelzell-ATAC-seq mit 10x Chromium: Für die Library Präparation wird eine Einzelnucleussuspension benötigt, die aus frischen, kryokonservierten und tiefgefrorenen Gewebe- oder Zellproben hergestellt wurde. Wie bei der Einzelzell-RNA-Seq wird bei der Einzelnucleuspräparation zunächst auf Qualität und Konzentration geprüft. In jeder Probe können 500-10.000 Zellen gezielt untersucht werden. Da die Probenvorbereitung für einzelne Zellen sofort nach ihrer Ankunft vom GMAK Personal bearbeitet werden muss, hat der Nutzer die Arbeit im Voraus zu planen (mindestens zwei Wochen).
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos.
Einreichung von Proben
Standard ATAC-seq: Als Input für ATAC-seq wird markierte genomische DNA benötigt. Die Anzahl der Zellen ist entscheidend für den Erfolg des Projekts, wobei 50.000 Zellen ein guter Ausgangspunkt sind. Gesunde Zellen in einer homogenen Einzelzellsuspension funktionieren am besten.
Einzelzell-ATAC-seq: Für die Bibliotheksvorbereitung wird eine Einzelzellsuspension aus frischen, kryokonservierten und tiefgefrorenen Gewebe- oder Zellproben benötigt. Auf der 10x Genomics scATAC-seq Support-Seite sind Beispielprotokolle für die Probenvorbereitung aufgeführt. Die GMAK-Mitarbeiterinnen prüfen die Qualität und Konzentration der Präparation einzelner Zellen bei der Probenlieferung.
Es ist wichtig, die Probenanlieferung mit dem Personal der GMAK zu koordinieren, da die Proben sofort verarbeitet werden müssen. Es ist ratsam, die Arbeit mit der GMAK so früh wie möglich zu planen, noch vor der Zellpräparation.
Sequenziermodus
Standard ATAC-seq: Paired-End 50 bp reads sind in der Regel ausreichend für das Mapping von ATAC-seq reads auf das Referenzgenom.
Sequenziertiefe: Es werden mindestens 50 Millionen Reads pro Probe empfohlen.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage bereitgestellt. Rohdaten und Analyseergebnisse werden dem Nutzer in der Regel über den GMAK SFTP-Service zur Verfügung gestellt.
ChIP Sequencing
ChIP-seq ist eine Genomik-Technologie, die entwickelt wurde, um die Bindungsstellen eines DNA-interagierenden Proteins im gesamten Genom zu kartieren. Beispiele für DNA-interagierende Proteine sind Transkriptionsfaktoren, Histone und Enzyme für die Reparatur und Veränderung der DNA. Eine häufige Anwendung von ChIP-seq ist die Lokalisierung von Transkriptionsfaktor-Bindungsmustern unter verschiedenen Bedingungen, z. B. in Entwicklungsstadien oder unter pathologischen Bedingungen.
ChIP-seq beginnt mit der kovalenten Quervernetzung von DNA mit interagierenden Proteinen, dann wird das Chromatin in Fragmente zerlegt, gefolgt von der Anreicherung des interessierenden Proteins mit der gebundenen DNA durch Immunpräzipitation mit einem für das Protein spezifischen Antikörper. Nach der Dissoziation des angereicherten Protein-DNA-Komplexes werden die freigesetzten DNA-Fragmente einer Sequenzierung unterzogen. Ein wichtiger experimenteller Faktor beim ChIP-Seq-Verfahren ist die Qualität des bei der Anreicherung verwendeten Antikörpers, da die Verwendung eines Antikörpers von schlechter Qualität aufgrund der unspezifischen Ausfällung von DNA-Fragmenten zu einem hohen experimentellen Rauschen führen kann.
Sequenzierungsmodus
Ein 50-bp Paired End Lauf ist in den meisten Fällen ausreichend. Die Verwendung längerer Reads kann das Alignment der Reads erleichtern, insbesondere bei sich wiederholenden Regionen.
Service-Anfrage
Bei Bedarf wird eine kostenlose Projektberatung angeboten.
Einreichung der Probe
Für die Library Präparation werden 10 ng ChIP- und Input-DNA benötigt. Für die DNA-Quantifizierung werden fluorometrische Methoden, wie Qubit oder PicoGreen, bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard ChIP-Seq Bioinformatik Service umfasst Sequenzierungsdaten-QC, Alignment und Peak-Calling.
DNA Methylation Sequencing
Die Methylierung von Cytosinen ist ein wichtiger epigenomischer Mechanismus, der den primären genomischen Code moduliert. Dies führt zur Bildung von 5-Methylcytosinen (5mCs) an ausgewählten Stellen des Genoms. Die Cytosin-Methylierung reguliert die Genexpression und den Umbau des Chromatins und spielt daher eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Funktionen wie Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und Pluripotenz von Stammzellen. Eine abnorme DNA-Methylierung kann zu Krankheiten wie Krebs führen.
Die DNA-Methylierungssequenzierung ist eine neuere Technologie, die in der Regel auf der Bisulfit-Konvertierung basiert, um zwischen methylierten und nicht methylierten Cytosinen zu unterscheiden. Bei der Behandlung mit Bisulfit werden unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt, während 5mCs nicht reaktiv sind und erhalten bleiben. Bei der Sequenzierung werden unmethylierte Cytosine als Thymin gelesen, während methylierte Cytosine weiterhin als Cytosine gelesen werden.
Je nach Genomabdeckung kann die auf der Bisulfit-Konversion basierende Sequenzierung in GMAK entweder als Whole-Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) oder als Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) durchgeführt werden. WGBS ist teurer und die damit verbundene Datenanalyse ist sehr viel aufwendiger. RRBS hingegen bietet einen kosteneffizienten Ansatz zur Untersuchung der DNA-Methylierung durch die Entnahme von Proben aus CpG-reichen Regionen des Genoms. Zur Durchführung von RRBS wird genomische DNA mit einem Methylierungs-unempfindlichen Restriktionsenzym, wie z. B. MspI, verdaut. Die verdauten DNA-Fragmente werden dann einer Adapterligierung, einer Bisulfit-Konvertierung und einer PCR unterzogen, um eine Bibliothek für die Sequenzierung zu erstellen.
Sequenzierungsmodus
In den meisten Fällen wird ein Paired-End-Lauf mit 150 bp vorgeschlagen.
Service-Anfrage
Bei Bedarf wird eine kostenlose Projektberatung angeboten.
Einreichung der Probe
Für die Vorbereitung der Bibliothek sind 150 ng hochwertige genomische DNA erforderlich. Für die DNA-Quantifizierung werden fluorometrische Methoden, wie Qubit oder PicoGreen, bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau genug.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard Bioinformatik Service umfasst die Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten, das Alignment sowie die Lokalisierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung.
Nanopore Long-Reads Sequencing
Die Oxford-Nanopore-Sequenzierung ist eine Einzelmolekül-Sequenzierungsmethode der dritten Generation. Die Länge der von ihr erzeugten Sequenzier-Reads beträgt in der Regel 10-100 kb für den Long-Reads-Sequenziermodus und 100-300 kb für den Ultra-Long-Reads-Sequenziermodus. Die längsten bisher erzielten Readlängen betragen 4 Mb. Diese langen Reads werden für eine Reihe von Anwendungen benötigt (siehe unten), bei denen die Sequenzierung mit kurzen Reads Probleme bereitet.
Dank der kontinuierlichen Weiterentwicklung der Technologie liegt die Fehlerquote bei der Nanopore-Sequenzierung von Rohdaten bei 1 % und erreicht eine Genauigkeit von 99 % (Q20). Die Consensus-Genauigkeit kann Q47 bei 60-facher Abdeckung für menschliche DNA erreichen, indem mehrere Raw Reads aus einer genomischen Region zu einer einzigen Consensus-Sequenz kombiniert werden. Der häufigste Sequenzierfehler bei der Nanopore-Sequenzierung tritt in homopolymeren Regionen auf.
Oxford Nanopore bietet derzeit drei Hauptgeräte mit unterschiedlichem Datendurchsatz an, d. h. MinION, GridION und PromethION. MinION/GridION verwenden denselben Fließzellentyp, der typischerweise 10-20 Gb Daten produziert (maximal 30 Gb). Die beim PromethION verwendete Fließzelle hat einen Durchsatz von 50-100 Gb (maximal 170 Gb).
Im Folgenden sind einige der wichtigsten Anwendungen für die Oxford Nanopore-Sequenzierung aufgeführt:
- Nachweis struktureller Variationen
- Phasing von Einzelnukleotidvarianten
- Sequenzierung von Transkripten in voller Länge und Nachweis von Spleißisoformen
- Nachweis von Fusions-Transkripten
- De-novo-Genom Assembly
- Direkter Nachweis von epigenetischen Basenveränderungen auf DNA und RNA
Leselänge und Sequenzierleistung
Long-reads Sequenziermodus: 10-100 kb Länge. Gut geeignet für:
- de novo-Genom Assembly
- Haplotyp-Phasierung
- Erkennung struktureller Varianten
- Gesamter Datenoutput: 10-20 Gb pro MinION/GridION Flowcell, 50-100 Gb pro PromethION Flowcell
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos.
Einreichung der Probe
RNA-Seq: Die GMAK nimmt extrahierte Gesamt-RNA für RNA-seq oder angereicherte Poly(A)-mRNA für die direkte RNA-Modifikationssequenzierung. Die Qualität der RNA ist der wichtigste Faktor, der das Endergebnis bestimmt. Nach der Abgabe der Proben führen die Mitarbeiter des Kerns eine Qualitätskontrolle der Proben durch, die die Messung der Qubit-Konzentration und die Generierung der RNA-Integritätszahl (RIN) mit dem Fragment Analyzer vor der Erstellung der Bibliothek umfasst. Eine RIN von 8 ist erforderlich, um mit dem Aufbau von mRNA-seq-Bibliotheken fortzufahren. Eingereichte RNA-Proben müssen außerdem frei von DNA sein, und wir empfehlen, während der RNA-Extraktion immer einen DNase-Behandlungsschritt vorzusehen. Das Vorhandensein von genomischer DNA-Kontamination ist auf Bioanalyzer-Spuren im Bereich von 4-10 kb sichtbar.
DNA-Seq: Bei DNA-Proben, die für die Genomassemblierung verwendet werden, sind DNA-Reinheit und -Länge (in Mb) entscheidend, um Daten von hoher Qualität zu erhalten. Bitte wenden Sie sich für Ihr Projekt an die GMAK.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage bereitgestellt.
RNA-Sequencing
Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist die neueste Technologie zur Untersuchung des Transkriptoms, d. h. des vollständigen Satzes von RNA-Transkripten, die das Genom in einer Zelle oder Zellpopulation ablesen. Mit dieser Technologie werden RNA-Moleküle im Transkriptom direkt sequenziert, um ihre Herkunftsgene und ihre Häufigkeit zu bestimmen. Die RNA-Spezies müssen vor der Sequenzierung einen Vorbereitungsprozess für die Sequenzierungslibrary durchlaufen. Die Libraries werden dann sequenziert, um Millionen von Reads für jede Probe zu erzeugen. Nach der Sequenzierung werden die generierten Reads auf das Referenzgenom abgebildet, um ihren genomischen Ursprung zu identifizieren. Die Gesamtzahl der Reads, die einer bestimmten Genomregion zugeordnet werden, gibt Aufschluss über den Grad der Transkriptionsaktivität in dieser Region. Je höher die Transkriptionsaktivität einer Genomregion ist, desto mehr Kopien von RNA-Transkripten werden produziert und desto mehr RNA-Seq-Reads werden erzeugt. RNA-Seq ist im Wesentlichen ein Zählspiel.
GMAK bietet fünf Arten von RNA-Seq-Diensten an, die im Folgenden beschrieben werden:
- mRNA-Seq: Beginnt mit 100 ng bis 1 ug hochqualitativer total-RNA. Erstellt eine Library aus mit Poly-A angereicherten mRNA-Spezies. Das Ziel ist die Identifizierung differentiell exprimierter proteinkodierender Gene. Am häufigsten nachgefragt.
- Total RNA-Seq: Beginnt mit 100 ng bis 1 ug Gesamt-RNA. Die Libraryvorbereitung basiert auf der Abreicherung von rRNA. Zielt sowohl auf proteinkodierende Gene als auch auf lange nichtkodierende RNAs ab. Kann auch für degradierte RNA verwendet werden, z. B. aus FFPE- oder Laser-Capture-Mikrodissektat-Proben extrahiert.
- Low-input RNA-Seq: Geeignet für begrenzte Mengen an total-RNA im Bereich von 5-100 ng.
- Small RNA-Seq: Bereitet Sequenzierungslibraries für kleine RNA-Spezies, z. B. miRNAs, aus total-RNA vor. Es kann mit 100 ng bis 1 ug (Standard-Input) oder 5 bis 100 ng (Low-Input) Gesamt-RNA begonnen werden.
- Einzelzell-RNA-Seq
Benutzer, die noch keine Erfahrung mit Bulk-RNA-Seq haben, können sich an den Dokumenten der Plattform RNA-Seq Workflow Steps and Examples und dem RNA-Seq Decision Tree orientieren, um zu entscheiden, welche Art von RNA-Seq-Service benötigt wird.
Leselänge und Sequenzierungstiefe
- Standard mRNA- or total RNA-Seq: Paired-End 50 Reads werden meist für die Erstellung von allgemeinen Genexpressionsprofilen verwendet. Zur Untersuchung alternativer Spleißvarianten werden häufig längere Paired-End-Reads (bis zu 150 bp) angefordert. Bei der Sequenzierungstiefe sind 25-30 Millionen Reads pro Probe in der Regel für die Erstellung von allgemeinen Genexpressionsprofilen geeignet, während 40-50 Millionen Reads für die Erkennung von Spleißvarianten empfohlen werden.
- Low-input RNA-seq: Die Leselänge bleibt die gleiche wie bei der standardmäßigen mRNA- oder Gesamt-RNA-seq. Die Sequenzierungstiefe kann in Abhängigkeit von der Menge des Ausgangsmaterials bis zu einem gewissen Grad reduziert werden.
- Small RNA-seq: Small RNA-seq: GMAK generiert paired-end 50 bp Reads für Small RNA-seq. Die empfohlene Sequenzierungstiefe beträgt 5-10 Millionen Reads pro Probe.
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos
Sample Submission
GMAK nimmt nur extrahierte Gesamt-RNA für RNA-seq (keine Gewebe oder Zellen) an. Die Qualität der RNA ist der wichtigste Faktor, der das Endergebnis bestimmt. Nach der Abgabe der Proben führen die Mitarbeiter der Plattform eine Qualitätskontrolle der Proben durch, die die Messung der Qubit-Konzentration und die Generierung der RNA-Integritätsnummer (RIN) mit dem Fragment Analyzer vor der Erstellung der Library umfasst. Eine RIN von 8 ist erforderlich, um mit dem Erstellung von mRNA-seq-Libraries fortzufahren. Eingereichte RNA-Proben müssen außerdem frei von DNA sein, und wir empfehlen, während der RNA-Extraktion immer einen DNase-Behandlungsschritt vorzusehen. Das Vorhandensein von genomischer DNA-Kontamination ist auf Fragment Analyzer Spuren im Bereich von 4-10 kb sichtbar. In Situationen, in denen ein RNA-Abbau unvermeidlich ist, wie z. B. bei der Verwendung von FFPE-Gewebe, wird eine total-RNA-Seq empfohlen, da sie weniger von der Unversehrtheit der RNA abhängig ist. Verwenden Sie unser Sample Submission Formular für die Einreichung von Proben.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard Bioinformatik-Service umfasst Sequenzierungsdaten-QC, Alignment, Normalisierung und differenzielle Expressionsanalyse.
Single-Cell Sequencing
Die GMAK bietet seit 2017 die Einzelzellsequenzierung an. Diese hochmoderne Technologie bietet beispiellose Möglichkeiten zur Untersuchung von Zell-zu-Zell-Variationen, zur Identifizierung/Visualisierung verschiedener Zelltypen/-identitäten in einer Population und zur Ableitung von zellulären Entwicklungsverläufen. Um den Nutzern bei der Erreichung dieser Ziele zu helfen, unterstützt GMAK die Nutzer bei jedem Schritt dieses Prozesses - von der Zellvorbereitung über die Erstellung von Sequenzierbibliotheken bis hin zur bioinformatischen Analyse.
Mit der Weiterentwicklung der Technologie wird die Einzelzellsequenzierung immer vielfältiger, um unterschiedlichen Projektanforderungen gerecht zu werden. Derzeit bietet GMAK die Einzelzellsequenzierung im Hochdurchsatz auf der Grundlage der 10x Genomics-Technologie an
10x Genomics Chromium
- Zielzellzahl: 1.000-10.000 Zellen in jeder Probe
- Input-Typ: frisch zubereitete Einzelzellsuspension (oder Zellkern), fixierte Zellen (oder Nuclei), kryokonservierte und in FFPE eingebettete Zellen.
- Anwendungen: 3'- und 5'-RNA-Seq von Einzelzellen (oder Nuclei), T-Cell- und B-Cell-V(D)J-Clone Profiling, Cell Surface Protein Profiling, ATAC-Seq von Nuclei und Multiome (gleichzeitige ATAC-seq von Nuclei und RNA-Seq an denselben Zellen)
Service-Anfrage
Um ein Einzelzellsequenzierungsprojekt zu initiieren, kontaktieren Sie uns bitte. Die Projektberatung ist kostenlos. Es wird dringend empfohlen, sich vor Beginn eines Einzelzell-Sequenzierungsexperiments mit der GMAK zu beraten, um das Erreichen der Projektziele sicherzustellen.
Einreichung von Proben
Für alle Single-Cell Services vereinbaren Sie bitte im Voraus einen Termin für die Probeneinreichung mit uns.
Empfohlene Sequenzierparameter
- RNA-Seq Libraries - Read 1 von 28 bp (Zell-Barcode und UMI), i7-Index von 10 bp (Probenindex), i5-Index von 10 bp (Probenindex) und Read 2 von 90 bp (Transkript-Insert) mit einer Sequenzierungstiefe von >20.000 Reads pro Zelle;
- ATAC-Seq Libraries - Read 1 von 50 bp (Transponierte DNA), i7 Index von 8 bp (Probenindex), i5 Index von 16 bp (10x Barcode) und Read 2 von 49 bp (Transponierte DNA) mit einer Sequenzierungstiefe von >25.000 Reads pro Zelle
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage zur Verfügung gestellt.
Spatial Transcriptomics
Die 3D Transkriptomik (Spatial Transcriptomics) ermöglicht die Untersuchung der Genexpression im Kontext der Gewebsarchitektur, der Gewebemikroumgebung und der Zellgruppen (insbesondere in Verbindung mit der Einzelzellsequenzierung). Um den rasch wachsenden Bedarf an räumlichen -omics-Studien zu decken, arbeitet die GMAK mit der HZI Core Unit Mouse Histology and Pathology zusammen, die in der Abteilung VMED untergebracht ist. Durch diese interne Zusammenarbeit wird sichergestellt, dass die Nutzer Zugang zu den verschiedenen Techniken haben, die für die Durchführung eines typischen Arbeitsablaufs für die räumliche Analyse erforderlich sind, wie z. B. Gewebevorbereitung, Kryosektion, Färbung, Bildgebung, Qualitätskontrolle des Gewebeschnitts, Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek, Sequenzierung und Datenanalyse. Der etablierte Arbeitsablauf eignet sich sowohl für frisch gefrorenes (FF) als auch für formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe. Gewebeschnitte auf Standard-Glasobjektträgern können auch für die Visium-Plattform von 10x Genomics verwendet werden, da das bei GMAK vorhandene 10x CytAssist-Gerät den Probentransfer von bereits vorhandenen Objektträgern auf Visium-Objektträger ermöglicht. Die Visium-Plattform von 10x Genomics wird seit August 2023 angeboten.
Service-Anfrage
Bitte kontaktieren Sie die GMAK, um ein 3D Transkriptomik Projekt zu initiieren. Wir arbeiten hier eng mit den anderen HZI-Service Plattformen bei den verschiedenen Schritten des Arbeitsablaufs zusammen. Es ist unbedingt empfohlen, sich vor dem Start eines solchen Projektes mit der GMAK in Verbindung zu setzen, um das Erreichen der Projektziele sicherzustellen. Die Projektberatung ist kostenlos.
Whole Genome Sequencing
Whole-Genome-Sequencing (WGS) ist eine Methode zur Bestimmung der vollständigen DNA-Sequenz des Genoms eines Organismus, einschließlich der chromosomalen DNA und der mitochondrialen DNA. WGS bietet einen umfassenden Überblick über das Genom. WGS-Methoden können in De-novo-Sequenzierungsprojekte und Re-Sequenzierungsprojekte unterteilt werden. Welche Methode für welches Projekt? DNA-Seq_Decision_Tree
De novo WGS
Für die De-novo-Sequenzierung von Genomen sind lange Reads von Vorteil wie sie z. B. von Oxford Nanopore Sequenzern (MinION, GridION) generiert werden. Da in der GMAK diese Technologie zur Verfügung steht empfehlen wir einen hybriden Ansatz bei de novo WGS Projekten. Hier werden kurze Reads von Illumina Sequenzern und lange Reads von Oxford Nanopore (ONT) Sequenzern verwendet, um die Assemblierungsergebnisse für Genome zu verbessern.
WGS Re-Sequenzierung
WGS Re-Sequencing ist deutlich kosteneffizienter als de novo WGS, da es nur mit kurzen Reads durchgeführt werden kann, wenn ein hochwertiges assembliertes Referenzgenom zur Verfügung steht.
Sequenzierungsmodus
- Short Reads (Illumina): Paired-End-Lauf von mindestens 150bp, besser 300bp mit einer 50x Coverage des Genomes für eine Re-Sequenzierung und eine 100x Coverage des Genomes für eine de novo Sequenzierung
- Long Reads (ONT): 50x Coverage des Genomes für ein Hybrid-Assembly mit Illumina short reads und eine 200x Coverage des Genomes für eine de novo Sequenzierung
Wir empfehlen für die erfolgreiche de novo Sequenzierung von kleinen Genomen (Bakterien, Viren) unbedingt einen hybriden Ansatz, also die Kombination von kurzen Reads (Illumina) mit langen Reads (ONT).
Für die Methode der Re-Sequenzierung und dem damit verbundenen SNP/Variant Calling empfehlen wir die Verwendung von kurzen Reads (Illumina), da diese Sequenziertechnologie die momentan geringste Sequenzierfehlerrate und damit bessere Vorraussetzungen für nachfolgende qualitative Analyseschritte besitzt.
Service-Anfrage
Bei Bedarf wird eine kostenlose Projektberatung angeboten.
Einreichung der Probe
- Library Prep für Illumina Sequenzer: 150 ng hochwertige genomische DNA erforderlich.
- Library Prep für MinION Sequenzer (ONT) : 1µg HMW DNA
Für die DNA-Quantifizierung werden fluorometrische Methoden, wie Qubit oder PicoGreen, bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau genug.
Verwenden Sie unser Sample Submission Formular für die Einreichung von Proben.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard-Bioinformatik-Service umfasst je nach Methode die Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten, das Alignment, Assembly, Hybrid Assembly, SNP/Variant Calling und eine automatische Annotation.
Whole Exome Sequencing
Obwohl die proteinkodierende Region des Genoms (d. h. das Exom) nur einen kleinen Teil des Genoms ausmacht (weniger als 2 % beim Menschen), ist sie am besten annotiert. So enthält das menschliche Exom etwa 85 Prozent aller bekannten krankheitsbezogenen Varianten. Aufgrund ihrer Kosteneffizienz und der besseren Handhabbarkeit der Daten bietet die Whole-Exom-Sequenzierung (WES) einen idealen Ansatz, wenn eine Whole-Genom-Sequenzierung (WGS) nicht praktikabel oder erforderlich ist.
WES ermöglicht es den Nutzern, ihre Ressourcen auf die Gene zu konzentrieren, die am ehesten einen Einfluss auf den Phänotyp oder die Krankheit von Interesse haben. Durch das Vergleichen der Sequenzen mit der gesamten Aminosäure-kodierenden Region des Genoms führt es zur Identifizierung relevanter Varianten in einem breiten Spektrum von Anwendungen, einschließlich genetischer Krankheiten, Krebsentwicklung und Populationsgenetik.
GMAK verwendet einen Capture-basierten Ansatz, um Exom-Regionen für die Sequenzierung auszuwählen. Wir verwenden biotinylierte Nukleinsäure-Capture-Sequenzen, die komplementär zur Ziel-Exom Sequenz sind, um an genomische DNA-Bibliotheken für das Capture zu hybridisieren. Für unsere WES benötigen wir nur 150ng hochwertige genomische DNA (Human, Mouse).
Sequenziermodus
Für WES werden Paired-End-Läufe mit 100 oder 150 bp und min. 15Mio Reads per Sample empfohlen.
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos.
Einreichung der Proben
Für die WES werden 150 ng hochwertige humane genomische DNA benötigt. Für die Quantifizierung der DNA werden fluorometrische Methoden wie Qubit oder PicoGreen bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau genug.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard WES-Bioinformatik Service für die Detektierung von Varianten umfasst die Qualitätskontrolle der Sequenzierungsdaten, das Alignment und den Variant Call. Die Ergebnisse werden in Form von Variant Call Files (VCF) geliefert.
ATAC-Seq for Open Chromatin Profiling
Das eukaryotische Genom ist stark gepackt, um in den sehr begrenzten Zellraum zu passen. Infolgedessen ist der Zugang zu genomischen Informationen je nach dem Zustand der Zelle streng geregelt. Welche Regionen des Genoms zugänglich sind, sagt viel über den Zustand der Zelle aus. ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin, gekoppelt mit Next-Gen-Sequenzierung) ist eine Technik zur Lokalisierung zugänglicher Chromatinregionen.
Wie der Name schon sagt, basiert ATAC-seq auf dem Einsatz einer gentechnisch veränderten, hyperaktiven Transposase (Tn5), die die DNA in offenen Bereichen des Chromatins fragmentiert. Gleichzeitig werden die Enden der fragmentierten DNA mit Sequenzieradaptern markiert. Dieser Markierungsprozess ist ein wesentlicher Bestandteil der ATAC-Seq Library Präparation.
Standard-ATAC-seq: GMAK beginnt mit getaggter gDNA.
Einzelzell-ATAC-seq mit 10x Chromium: Für die Library Präparation wird eine Einzelnucleussuspension benötigt, die aus frischen, kryokonservierten und tiefgefrorenen Gewebe- oder Zellproben hergestellt wurde. Wie bei der Einzelzell-RNA-Seq wird bei der Einzelnucleuspräparation zunächst auf Qualität und Konzentration geprüft. In jeder Probe können 500-10.000 Zellen gezielt untersucht werden. Da die Probenvorbereitung für einzelne Zellen sofort nach ihrer Ankunft vom GMAK Personal bearbeitet werden muss, hat der Nutzer die Arbeit im Voraus zu planen (mindestens zwei Wochen).
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos.
Einreichung von Proben
Standard ATAC-seq: Als Input für ATAC-seq wird markierte genomische DNA benötigt. Die Anzahl der Zellen ist entscheidend für den Erfolg des Projekts, wobei 50.000 Zellen ein guter Ausgangspunkt sind. Gesunde Zellen in einer homogenen Einzelzellsuspension funktionieren am besten.
Einzelzell-ATAC-seq: Für die Bibliotheksvorbereitung wird eine Einzelzellsuspension aus frischen, kryokonservierten und tiefgefrorenen Gewebe- oder Zellproben benötigt. Auf der 10x Genomics scATAC-seq Support-Seite sind Beispielprotokolle für die Probenvorbereitung aufgeführt. Die GMAK-Mitarbeiterinnen prüfen die Qualität und Konzentration der Präparation einzelner Zellen bei der Probenlieferung.
Es ist wichtig, die Probenanlieferung mit dem Personal der GMAK zu koordinieren, da die Proben sofort verarbeitet werden müssen. Es ist ratsam, die Arbeit mit der GMAK so früh wie möglich zu planen, noch vor der Zellpräparation.
Sequenziermodus
Standard ATAC-seq: Paired-End 50 bp reads sind in der Regel ausreichend für das Mapping von ATAC-seq reads auf das Referenzgenom.
Sequenziertiefe: Es werden mindestens 50 Millionen Reads pro Probe empfohlen.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage bereitgestellt. Rohdaten und Analyseergebnisse werden dem Nutzer in der Regel über den GMAK SFTP-Service zur Verfügung gestellt.
ChIP Sequencing
ChIP-seq ist eine Genomik-Technologie, die entwickelt wurde, um die Bindungsstellen eines DNA-interagierenden Proteins im gesamten Genom zu kartieren. Beispiele für DNA-interagierende Proteine sind Transkriptionsfaktoren, Histone und Enzyme für die Reparatur und Veränderung der DNA. Eine häufige Anwendung von ChIP-seq ist die Lokalisierung von Transkriptionsfaktor-Bindungsmustern unter verschiedenen Bedingungen, z. B. in Entwicklungsstadien oder unter pathologischen Bedingungen.
ChIP-seq beginnt mit der kovalenten Quervernetzung von DNA mit interagierenden Proteinen, dann wird das Chromatin in Fragmente zerlegt, gefolgt von der Anreicherung des interessierenden Proteins mit der gebundenen DNA durch Immunpräzipitation mit einem für das Protein spezifischen Antikörper. Nach der Dissoziation des angereicherten Protein-DNA-Komplexes werden die freigesetzten DNA-Fragmente einer Sequenzierung unterzogen. Ein wichtiger experimenteller Faktor beim ChIP-Seq-Verfahren ist die Qualität des bei der Anreicherung verwendeten Antikörpers, da die Verwendung eines Antikörpers von schlechter Qualität aufgrund der unspezifischen Ausfällung von DNA-Fragmenten zu einem hohen experimentellen Rauschen führen kann.
Sequenzierungsmodus
Ein 50-bp Paired End Lauf ist in den meisten Fällen ausreichend. Die Verwendung längerer Reads kann das Alignment der Reads erleichtern, insbesondere bei sich wiederholenden Regionen.
Service-Anfrage
Bei Bedarf wird eine kostenlose Projektberatung angeboten.
Einreichung der Probe
Für die Library Präparation werden 10 ng ChIP- und Input-DNA benötigt. Für die DNA-Quantifizierung werden fluorometrische Methoden, wie Qubit oder PicoGreen, bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard ChIP-Seq Bioinformatik Service umfasst Sequenzierungsdaten-QC, Alignment und Peak-Calling.
DNA Methylation Sequencing
Die Methylierung von Cytosinen ist ein wichtiger epigenomischer Mechanismus, der den primären genomischen Code moduliert. Dies führt zur Bildung von 5-Methylcytosinen (5mCs) an ausgewählten Stellen des Genoms. Die Cytosin-Methylierung reguliert die Genexpression und den Umbau des Chromatins und spielt daher eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Funktionen wie Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und Pluripotenz von Stammzellen. Eine abnorme DNA-Methylierung kann zu Krankheiten wie Krebs führen.
Die DNA-Methylierungssequenzierung ist eine neuere Technologie, die in der Regel auf der Bisulfit-Konvertierung basiert, um zwischen methylierten und nicht methylierten Cytosinen zu unterscheiden. Bei der Behandlung mit Bisulfit werden unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt, während 5mCs nicht reaktiv sind und erhalten bleiben. Bei der Sequenzierung werden unmethylierte Cytosine als Thymin gelesen, während methylierte Cytosine weiterhin als Cytosine gelesen werden.
Je nach Genomabdeckung kann die auf der Bisulfit-Konversion basierende Sequenzierung in GMAK entweder als Whole-Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) oder als Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) durchgeführt werden. WGBS ist teurer und die damit verbundene Datenanalyse ist sehr viel aufwendiger. RRBS hingegen bietet einen kosteneffizienten Ansatz zur Untersuchung der DNA-Methylierung durch die Entnahme von Proben aus CpG-reichen Regionen des Genoms. Zur Durchführung von RRBS wird genomische DNA mit einem Methylierungs-unempfindlichen Restriktionsenzym, wie z. B. MspI, verdaut. Die verdauten DNA-Fragmente werden dann einer Adapterligierung, einer Bisulfit-Konvertierung und einer PCR unterzogen, um eine Bibliothek für die Sequenzierung zu erstellen.
Sequenzierungsmodus
In den meisten Fällen wird ein Paired-End-Lauf mit 150 bp vorgeschlagen.
Service-Anfrage
Bei Bedarf wird eine kostenlose Projektberatung angeboten.
Einreichung der Probe
Für die Vorbereitung der Bibliothek sind 150 ng hochwertige genomische DNA erforderlich. Für die DNA-Quantifizierung werden fluorometrische Methoden, wie Qubit oder PicoGreen, bevorzugt. Spektralphotometrische Methoden, wie Nanodrop, sind möglicherweise nicht genau genug.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage angeboten. Der Standard Bioinformatik Service umfasst die Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten, das Alignment sowie die Lokalisierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung.
Nanopore Long-Reads Sequencing
Die Oxford-Nanopore-Sequenzierung ist eine Einzelmolekül-Sequenzierungsmethode der dritten Generation. Die Länge der von ihr erzeugten Sequenzier-Reads beträgt in der Regel 10-100 kb für den Long-Reads-Sequenziermodus und 100-300 kb für den Ultra-Long-Reads-Sequenziermodus. Die längsten bisher erzielten Readlängen betragen 4 Mb. Diese langen Reads werden für eine Reihe von Anwendungen benötigt (siehe unten), bei denen die Sequenzierung mit kurzen Reads Probleme bereitet.
Dank der kontinuierlichen Weiterentwicklung der Technologie liegt die Fehlerquote bei der Nanopore-Sequenzierung von Rohdaten bei 1 % und erreicht eine Genauigkeit von 99 % (Q20). Die Consensus-Genauigkeit kann Q47 bei 60-facher Abdeckung für menschliche DNA erreichen, indem mehrere Raw Reads aus einer genomischen Region zu einer einzigen Consensus-Sequenz kombiniert werden. Der häufigste Sequenzierfehler bei der Nanopore-Sequenzierung tritt in homopolymeren Regionen auf.
Oxford Nanopore bietet derzeit drei Hauptgeräte mit unterschiedlichem Datendurchsatz an, d. h. MinION, GridION und PromethION. MinION/GridION verwenden denselben Fließzellentyp, der typischerweise 10-20 Gb Daten produziert (maximal 30 Gb). Die beim PromethION verwendete Fließzelle hat einen Durchsatz von 50-100 Gb (maximal 170 Gb).
Im Folgenden sind einige der wichtigsten Anwendungen für die Oxford Nanopore-Sequenzierung aufgeführt:
- Nachweis struktureller Variationen
- Phasing von Einzelnukleotidvarianten
- Sequenzierung von Transkripten in voller Länge und Nachweis von Spleißisoformen
- Nachweis von Fusions-Transkripten
- De-novo-Genom Assembly
- Direkter Nachweis von epigenetischen Basenveränderungen auf DNA und RNA
Leselänge und Sequenzierleistung
Long-reads Sequenziermodus: 10-100 kb Länge. Gut geeignet für:
- de novo-Genom Assembly
- Haplotyp-Phasierung
- Erkennung struktureller Varianten
- Gesamter Datenoutput: 10-20 Gb pro MinION/GridION Flowcell, 50-100 Gb pro PromethION Flowcell
Service-Anfrage
Die Projektberatung ist kostenlos.
Einreichung der Probe
RNA-Seq: Die GMAK nimmt extrahierte Gesamt-RNA für RNA-seq oder angereicherte Poly(A)-mRNA für die direkte RNA-Modifikationssequenzierung. Die Qualität der RNA ist der wichtigste Faktor, der das Endergebnis bestimmt. Nach der Abgabe der Proben führen die Mitarbeiter des Kerns eine Qualitätskontrolle der Proben durch, die die Messung der Qubit-Konzentration und die Generierung der RNA-Integritätszahl (RIN) mit dem Fragment Analyzer vor der Erstellung der Bibliothek umfasst. Eine RIN von 8 ist erforderlich, um mit dem Aufbau von mRNA-seq-Bibliotheken fortzufahren. Eingereichte RNA-Proben müssen außerdem frei von DNA sein, und wir empfehlen, während der RNA-Extraktion immer einen DNase-Behandlungsschritt vorzusehen. Das Vorhandensein von genomischer DNA-Kontamination ist auf Bioanalyzer-Spuren im Bereich von 4-10 kb sichtbar.
DNA-Seq: Bei DNA-Proben, die für die Genomassemblierung verwendet werden, sind DNA-Reinheit und -Länge (in Mb) entscheidend, um Daten von hoher Qualität zu erhalten. Bitte wenden Sie sich für Ihr Projekt an die GMAK.
Bioinformatik
Die Datenanalyse wird auf Anfrage bereitgestellt.
Dr. Robert Geffers
Am Faden des Lebens ist noch Platz – für ein ganzes Forscherleben.
Robert Geffers studierte Biologie an der Universität Hamburg und schloss 1996 mit dem Diplom ab. Schon während des Studiums stand für ihn die angewandte Genomforschung im Vordergrund. In seiner Dissertation an der Technischen Universität Braunschweig beschäftigte er sich mit den molekularen Mechanismen der Genregulation. Noch während seiner Promotionszeit wechselte er als Projektleiter in das Bioinformatik Unternehmen BIOBASE GmbH in Wolfenbüttel, um dort die Entwicklung Datenbank gestützter Modellierung pflanzlicher Genregulationsnetzwerke zu übernehmen.
Im Jahr 2002 wechselte er in die Nachwuchsarbeitsgruppe „Mukosale Immunität“ am HZI, damals GBF. Im Jahr 2003 übernahm er die Leitung und etablierte die Mikroarray Analytik zu einem zentrumsweiten Transkriptomanalytik Service. Seit 2011 leitet Robert Geffers die Arbeitsgruppe „Genomanalytik“ im Rahmen der wissenschaftlichen Serviceeinrichtungen am HZI und ermöglicht Wissenschaftlern modernste Technologien zur Analyse des Genoms, Epigenoms und Transkriptoms zu nutzen.
Zudem ist er Gründungsmitglied des Braunschweiger Systembiologie-Zentrums BRICS.
Team
Ausgewählte Publikationen
Kruse B, Buzzai AC, Shridhar N, Braun AD, Gellert S, Knauth K, Pozniak J, Peters J, Dittmann P, Mengoni M, van der Sluis TC, Hohn S, Antoranz A, Krone A, Fu Y, Yu D, Essand M, Geffers R, Mougiakakos D, Kahlfuss S, Kashkar H, Gaffal E, Bosisio FM, Bechter O, Rambow F, Marine JC, Kastenmuller W, Muller AJ, Tuting T. CD4(+) T cell-induced inflammatory cell death controls immune-evasive tumours. Nature. Jun 2023;618(7967):1033-1040. DOI: 10.1038/s41586-023-06199-x
Sohail A, Iqbal AA, Sahini N, Chen F, Tantawy M, Waqas SFH, Winterhoff M, Ebensen T, Schultz K, Geffers R, Schughart K, Preusse M, Shehata M, Bahre H, Pils MC, Guzman CA, Mostafa A, Pleschka S, Falk C, Michelucci A, Pessler F. Itaconate and derivatives reduce interferon responses and inflammation in influenza A virus infection. PLoS Pathog. Jan 2022;18(1):e1010219. DOI: 10.1371/journal.ppat.1010219
Riese P, Trittel S, Akmatov MK, May M, Prokein J, Illig T, Schindler C, Sawitzki B, Elfaki Y, Floess S, Huehn J, Blazejewski AJ, Strowig T, Hernandez-Vargas EA, Geffers R, Zhang B, Li Y, Pessler F, Guzman CA. Distinct immunological and molecular signatures underpinning influenza vaccine responsiveness in the elderly. Nat Commun. Nov 12 2022;13(1):6894. DOI: 10.1038/s41467-022-34487-z
Wendisch D, Dietrich O, Mari T, von Stillfried S, Ibarra IL, Mittermaier M, Mache C, Chua RL, Knoll R, Timm S, Brumhard S, Krammer T, Zauber H, Hiller AL, Pascual-Reguant A, Mothes R, Bulow RD, Schulze J, Leipold AM, Djudjaj S, Erhard F, Geffers R, Pott F, Kazmierski J, Radke J, Pergantis P, Bassler K, Conrad C, Aschenbrenner AC, Sawitzki B, Landthaler M, Wyler E, Horst D, Deutsche C-OI, Hippenstiel S, Hocke A, Heppner FL, Uhrig A, Garcia C, Machleidt F, Herold S, Elezkurtaj S, Thibeault C, Witzenrath M, Cochain C, Suttorp N, Drosten C, Goffinet C, Kurth F, Schultze JL, Radbruch H, Ochs M, Eils R, Muller-Redetzky H, Hauser AE, Luecken MD, Theis FJ, Conrad C, Wolff T, Boor P, Selbach M, Saliba AE, Sander LE. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. Dec 22 2021;184(26):6243-6261 e6227. DOI: 10.1016/j.cell.2021.11.033
Schulte-Schrepping J, Reusch N, Paclik D, Bassler K, Schlickeiser S, Zhang B, Kramer B, Krammer T, Brumhard S, Bonaguro L, De Domenico E, Wendisch D, Grasshoff M, Kapellos TS, Beckstette M, Pecht T, Saglam A, Dietrich O, Mei HE, Schulz AR, Conrad C, Kunkel D, Vafadarnejad E, Xu CJ, Horne A, Herbert M, Drews A, Thibeault C, Pfeiffer M, Hippenstiel S, Hocke A, Muller-Redetzky H, Heim KM, Machleidt F, Uhrig A, Bosquillon de Jarcy L, Jurgens L, Stegemann M, Glosenkamp CR, Volk HD, Goffinet C, Landthaler M, Wyler E, Georg P, Schneider M, Dang-Heine C, Neuwinger N, Kappert K, Tauber R, Corman V, Raabe J, Kaiser KM, Vinh MT, Rieke G, Meisel C, Ulas T, Becker M, Geffers R, Witzenrath M, Drosten C, Suttorp N, von Kalle C, Kurth F, Handler K, Schultze JL, Aschenbrenner AC, Li Y, Nattermann J, Sawitzki B, Saliba AE, Sander LE, Deutsche C-OI. Severe COVID-19 Is Marked by a Dysregulated Myeloid Cell Compartment. Cell. Sep 17 2020;182(6):1419-1440 e1423. DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.001
Publikationen
NGS-Ausstattung
Geräte für die Qualitätskontrolle (QC)
Fragmentanalyzer 5200
Der Fragment Analyzer ist ein paralleles Kapillarelektrophorese-System zur Qualifizierung und Quantifizierung von Nukleinsäuren für 12 Proben parallel. Er führt DNA- und RNA-Qualitätskontrollen (QC) für ein breites Spektrum von Proben durch, darunter gDNA, small RNA, large DNA-Fragmente, total-RNA und mRNA sowie Library-QC für Next Generation Sequencing (NGS).
Der Fragment Analyzer verfügt über zahlreiche erweiterte Funktionen, darunter:
- verschiedene quantitative Kit-Optionen für genomische DNA (gDNA), NGS-Libraries, small RNA, total-RNA und Boten-RNA (mRNA)
- automatisierter Wechsel zwischen Anwendungen mit zwei Gel-Vorlagen
- das Multitray-Format umfasst drei 96-Well-Standardplatten für die automatisierte Analyse von bis zu 288 Proben
- minimaler Zeitaufwand für die Einrichtung des Geräts und die Handhabung der Proben
- hohe analytische Sensitivität für den Nachweis von Konzentrationen bis zu 5 pg/μl für Fragmente und 50 pg/μl für Smear-Analysen
Qubit
Das Qubit 4 Fluorometer bestimmt präzise und schnell die Konzentration von DNA, RNA oder Protein in einer einzigen Probe. Es kann auch verwendet werden, um die Integrität und Qualität von RNA zu beurteilen. Qubit-Fluorometer weisen Fluoreszenzfarbstoffe nach, die spezifisch an das Zielmolekül gebunden sind. Selbst bei extrem niedrigen Konzentrationen oder bei Vorhandensein von Verunreinigungen ermöglichen optimierte Qubit-Assays die Unterscheidung von dsDNA und ssDNA oder von intakter und abgebauter RNA.
Es sind verschiedene Qubit-Kits vorhanden, für DNA (5 ng bis 2 µg) und für RNA (5 ng bis 1.2 µg).
Sequenziergeräte:
- SP-Flowcell: 400 Millionen Reads pro Lane, 2 Lanes pro Flowcell. Verfügbare Leselängen: 2x50, 2x150, 2x250 bp.
- S1-Flowcell: 800 Millionen Reads pro Lane, 2 Lanes pro Flowcell. Verfügbare Leselängen: 2x50, 2x100 und 2x150 bp
- S2-Flowcell: 2050 Millionen Reads pro Lane, 2 Lanes pro Flowcell. Verfügbare Read-Längen: 2x50, 2x100 und 2x150 bp
- S4-Flowcell: 2500 Millionen Reads pro Lane, 4 Lanes pro Flowcell. Verfügbare Leselängen: 2x100 und 2x150 bp
Illumina MiSeq
- 1, 4, 15 bis 25 Millionen Reads aus einer Flowcell, der Output ist abhängig vom Flowcelltyp, nur eine Lane
- Verfügbare Leselängen: 2x150, 2x250 und 2x300 bp
Oxford Nanopore Technology MinION
- Long-Read-Sequenzierung mit Leselängen von bis zu 4 Mbp, typischerweise 10-100 kb für Long-Read-Sequenzierung und 100-300 kb für den Ultra-Long-Read-Sequenzierungsmodus
- MinION: 10-20 Gb Daten pro MinION-Flowcell
zusätzliche NGS-Laborausstattung:
BluePippin
Der BluePippin ist eine präparative Elektrophoreseplattform für die Größenselektion von DNA- oder Proteinproben unter Verwendung von vorgefertigten Einweg-Agarosekassetten zur Extraktion von Fraktionen entsprechend der benutzerdefinierten Software-Eingabe. Die Zielgrößen oder Größenbereiche werden in die Software eingegeben, die Fraktionen werden in Puffer gesammelt.
Es können bis zu 5 Proben/Gelkassette durchgeführt werden, ohne dass eine Kreuzkontamination möglich ist.
Roche Light Cycler 480
Der Roche LightCycler wird zur Durchführung von qPCR benutzt, zur absoluten oder relativen Quantifizierung von Nucleinsäuren.
Pipettierroboter:
epMotion 5075
Die epMotion 5075t NGS Solution ist ein Liquid-Handling-System und enthält alle erforderlichen Dosierwerkzeuge, Zubehör und Verbrauchsartikel für die Erstellung von NGS-Bibliotheken mit bis zu 96 Proben. Sie automatisiert das Verfahren, liefert reproduzierbare und präzise Ergebnisse und erhöht die Produktivität des Labors.
epMotion 5073
Der epMotion 5073 ist ein automatisches Liquid-Handling-Systeme und vereinfacht traditionell komplexe und laborintensive Pipettieraufgaben, spart Zeit und verbessert die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Biomek® FXP-Pipettierroboter
Der Biomek von Beckman Coulter ist ein automatisches Liquid-Handling-Systeme und vereinfacht laborintensive Pipettieraufgaben und verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Geräte zur Einzelzell-Analyse
Chromium Controller
Der Chromium Controller nutzt spezielle Mikrofluidik für die Trennung und das Barcoding einzelner Zellen in wenigen Minuten. Auf der Grundlage der Next GEM-Technologie sind multimodale Analysen von Hunderten bis Zehntausenden von Einzelzellen möglich.
Chromium Controller iX
Das Chromium iX ist eine Erweiterung des Chromium Controllers und ermöglicht auch die Einzelzellanalyse aus fixierten Zellen.
Visium CytAssist
Der Visium CytAssist ist ein Instrument, das den Transfer von transkriptomischen Sonden von Standard-Glasobjektträgern auf Visium-Objektträger erleichtert und somit Einblicke in das gesamte transkriptomische räumliche Profiling Ihres Gewebeschnitts sowie eine erweiterte Kompatibilität mit FFPE- und/oder FF-Proben ermöglicht.
Bioinformatik
Neben der Erstellung von Next-Generation-Sequencing (NGS)-Daten bieten wir bioinformatische Analysen, die auf jedes Projekt zugeschnitten sind. Durch den Einsatz modernster Techniken, neuester Analysen und spezieller statistisch fundierter Methoden nutzen wir computergestützte Ansätze, um ein breites Spektrum biologischer Fragestellungen zu bearbeiten.
Ähnlich wie bei vielen anderen Sequenzierplattformen vereinbaren wir zunächst einen Termin für ein persönliches Gespräch oder ein Zoom-Meeting, um Ihre Projektanforderungen, den Zeitplan und die Budgetvorgaben umfassend zu verstehen. Im Anschluss an diese Konsultation beurteilen wir, ob wir das Projekt durchführen können und skizzieren, wie wir die Ergebnisse liefern werden. Wenn beide Parteien einverstanden sind, werden wir die Vereinbarung durch die Unterzeichnung eines Vertrags formalisieren, der unsere gegenseitigen Verpflichtungen festlegt. Da unsere Arbeit auf der Forschung basiert, kann nicht jede wissenschaftliche Frage wie erwartet gelöst werden. Es kann sein, dass wir häufiger Gespräche führen müssen, um den sich entwickelnden Bedürfnissen und Umständen Rechnung zu tragen.
Primäre Datenanalyse
In der Phase der primären Datenverarbeitung werden die von den Sequenziergeräten erzeugten Rohdaten im BCL/POD5/FASTQ5-Format in qualitätsgesicherte Nukleotidsequenzen umgewandelt, die als FASTQ-Dateien formatiert sind und für die nachfolgenden Datenverarbeitungsschritte benötigt werden. Außerdem werden in dieser Phase verschiedene Proben nach Index demultiplexiert, ein QC-Bericht und Prüfsummendateien erstellt, um die Integrität der zu übertragenen Datendateien zu gewährleisten. Dieser Prozess ist von entscheidender Bedeutung, wenn der Sequenzierservice der NGS-Plattform am HZI in Anspruch genommen wird. Die primäre Datenanalyse ist im Sequenzierservice der NGS-Plattform ohne zusätzliche Kosten enthalten.
Sekundäre Datenanalyse
Eine sekundäre Datenanalyse erfolgt auf Anfrage und nach einer Projektberatung. Wir bieten grundlegende Datenanalysen für Einzelzell- und Bulk-Sequenzierungsdaten auf verschiedenen Plattformen und Technologien an, die auch die Aufbereitung von veröffentlichten oder öffentlichen Datensätzen umfassen. Unsere Analysepipelines führen alle wesentlichen Schritte aus, die für Tertiäranalysen erforderlich sind, wie z. B. Assembly-Alignment, Peak-Calling und Feature-Counting und erstellen gleichzeitig einen QC-Bericht.
- Datenmanagement (Speicherung, Meta-Tabellen-Management, ENA/GEO-Einreichung)
- DNA-seq-Analyse (von Rohsequenzierungsdaten bis zu QC, de novo Assembly und automatische Annotation, SNPs/Variantenaufruf aus Genotypisierungs-/WGS/WES-Daten)
- RNA-seq-Analyse (von Rohsequenzierungsdaten über QC bis hin zu normalisierten Genexpressionstabellen, Gruppenvergleichen, Pfadanalysen und interaktiver Berichterstattung und Visualisierung der Ergebnisse)
- Small RNA-seq-Analyse (miRNAs )
- Einzelzell-Omics-Analyse (10x Genomics-Pipeline, Clustering, Trajektorienanalyse, räumliche Transkriptomik)
- ChIP-seq-Analyse (z. B. QC, Peak-Calling, differentielle Bindung, Visualisierung im UCSC Genome Browser)
- Analyse anderer NGS-Daten (ATAC-seq)
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