Metabolisches Engineering von Aktinomyzeten

Die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen ist ein zunehmendes Problem bei der Therapie von Infektionskrankheiten. Die Entwicklung neuer antibiotischer Medikamente basiert häufig auf bereits bekannten Molekülen und Wirkprinzipien, so dass die Bakterien sich schnell anpassen können. Aus diesem Grund, suchen Wissenschaftler nach ganz neuen Wirkstoffen. Am Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland (HIPS), einer Außenstelle des HZI, entwickeln sie neue Wege, mit denen sie Aktinomyceten bislang unbekannte Stoffe entlocken.

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Regulatorische Gen-Netzwerke, die für die heterologe Expression in S. albus und S. lividans verantwortlich sind

Die Expression sekundärmetabolischer Gen-Cluster wird durch verschiedene Familien von Regulations-Proteinen kontrolliert, von denen man einige nur in Aktinomyzeten findet. Die Expression wird durch extrazelluläre wie auch intrazelluläre Signalmoleküle ausgelöst. Mit Hilfe systematischer in vivo Transposon-Mutagenese kombiniert mit gusA-basiertem Screening konnten wir Gen-Netzwerke identifizieren, die für das An- und Abschalten der Naturstoff-Biosynthese in Streptomyzeten verantwortlich sind.

In Aktinomyzeten sind Himar1- und Tn5-Transposone sehr effizient

Streptomyces globisporus wild type and its transposon mutant with impaired aerial mycelium formation.
Streptomyces globisporus wild type and its transposon mutant with impaired aerial mycelium formation.

Die in vivo Transposon-basierte Strategie ist ein wertvolles Instrument, um Regulationsgene von Sekundär-Metaboliten zu identifizieren, die durch in silico Ansätze nicht lokalisiert werden können. Obwohl wir ein Derivat des Transposons Tn5 erfolgreich in unserem Labor so weit entwickelt haben, dass tatsächlich zufällige Mutationen in Aktinomyzeten durchgeführt werden können, minimiert der Einsatz weiterer Transposone wegen der spezifischer aber unterschiedlichen Affinitäten die Anzahl bisher nicht-adressierter Stellen. Wir haben deshalb ein zusätzliches Transposon entwickelt, ein Derivat von Himar1, einem Mitglied der Familie Mariner, welches aus der Kleinen Weidestechfliege (Haematobia irritans) isoliert wurde. Das Himar1 kodierende synthetische Gen wurde synthetisiert und mit den induzierbaren Promotoren tipA und tcp exprimiert.

Die DNA-Fragmente, die Apramyzin- und Spektinomyzin-Resistenzgene besitzen und an das R6Ky-Ori gebunden sind, wurden als Mini-Transposon genutzt. Zusätzlich haben wir am Ende des Mini-Transposons ermE und tcp als nach außen gewandte Promotoren eingefügt, um flankierende Gene im Chromosom überzuexprimieren. Somit werden unsere Minitransposone nicht nur Gene durch deren Einbau unterbrechen, sondern auch offene Leseraster („open reading frames“) im Aktinomyzeten-Chromosom aktivieren (überexprimieren). Die Einbaufrequenz für das hyperaktive Tn5-Derivat und von Himar1 war größer als 98% der veränderten S. lividans and S. coelicolor Zellen.

Das benutzte Transposon enthält zudem einen Apramyzin-Resistenzmarker, der in den meisten Streptomyzeten sehr effizient ist und den R6Kgamma Replikations-Ursprung, das ein schnelles und einfaches Klonieren der Insertionsstelle direkt vom Chromosom her erlaubt.

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  • HIPS Infofilm

    Antibiotika-Resistenzen sind weltweit eine der großen Herausforderungen bei Infektionskrankheiten. Hier setzt das neue Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland (HIPS) an.

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