Master Thesis - Herstellung von Intrazellulären Antikörpern gegen den Transkriptsfaktor IE1 von Cytomegalovirus

• Infektion und Immunität
• Im Kern von mit Cytomegalovirus infizierten Zellen induziert das immediately early Protein IE1 des Virus die Expression von delayed early and late virus Genen. Zur genauen Analyse der in vitro und in vivo Funktion des Virusproteins sollen Intrazelluläre Antikörper (Intrabodies), die spezifisch das Protein erkennen, hergestellt werden. Intrabodies können in unterschiedliche Kompartimente einer Zelle (Cytoplasma, Endoplasmatisches Retikulum und Kern) transportiert werden, binden dort ihr spezifisches Antigen und inhibieren somit dessen Funktion.
• Ziel der Arbeit: Für die Konstruktion des Intrabodies werden die variablen Domänen der schweren und leichten Kette eines anti-CMV IE1 Hybridoma Antikörpers mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Danach wird ein scFv Fragment aus den variablen Domänen konstruiert und in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert. Um eine stabile Expression eines korrekt gefalteten Intrabodies im Nukleus zu erreichen, wird die kodierende Sequenz des scFv Fragmentes an das VP22 Protein von Herpes simplex virus I fusioniert. In einem parallelen Ansatz wird das Fusionsprotein vom Kern in das Zytoplasma mit einer Nukleären Exportsequenz (NES) transportiert. Die Funktionsanalyse des Intrabodies erfolgt in der Immunofluoreszenz mit CMV infizierten Fibroblasten.
• Methoden: RT-PCR, Konstruktion von rekombinanten Antikörperfragmenten (scFv Fragmenten), Klonierung und Expression rekombinanter Antikörper in Säugetierzellen. Funktionsanalyse des Intrabodies mittels Immunofluoreszenz.
• Publikationen:
• (1) Böldicke T. (2007). Blocking translocation of cell surface molecules from the ER to the cell surface by intracellular antibodies targeted to the ER. J. Cell.Mol.Med. 11 (1): 54-70.
• (2) Kirschning CJ, Dreher S, Maaß B, Fichte S, Schade J, Köster M, Noack A, Lindenmaier W, Wagner H, Böldicke T (2010). Generation of anti-TLR2 intrabody mediating inhibition of macrophage surface TLR2 expression and TLR2-driven cell activation. BMC Biotechnol. 2010: 10.31.

Dr. Thomas Böldicke, Email: thomas.boeldicke@helmholtz-hzi.de, Tel.: 0531-6181-5050.